Conclui o curso em 1906 e começa a pesquisar, em seguida, substâncias com potencial bactericida que não sejam tóxicas ao organismo humano. Chega à descoberta da penicilina e de suas propriedades antibióticas em 1928, ao observar uma cultura de bactérias do tipo estafilococo e o desenvolvimento do mofo a seu redor, onde as bactérias circulam livres.
Aprofunda a pesquisa e constata que uma cultura líquida de mofo do gênero Penicillium evita o crescimento dos estafilococos. Publica os resultados desses estudos em 1929, mas não obtém reconhecimento nem recursos financeiros para aperfeiçoar o produto durante os anos seguintes.
Só consegue transformar a penicilina em medicamento antibiótico uma década depois da publicação de suas pesquisas, com o apoio dos cientistas norte-americanos Howard Walter Florey e Ernest Boris Chain. A produção industrial começa nos Estados Unidos (EUA) no início da II Guerra Mundial. Fleming, Florey e Chain recebem juntos o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina de 1945.