Em 1532 marca sua adesão à Reforma Protestante com a obra Dois Livros sobre a Clemência ao Imperador Nero. Em 1535, aos 26 anos, é reconhecido como chefe do protestantismo francês. Muda-se para Genebra, na Suíça, para disseminar o novo credo, mas é perseguido pelas autoridades católicas e obrigado a refugiar-se em Estrasburgo - território francês.
Três anos depois, volta a Genebra e organiza uma nova Igreja, com pastores escolhidos pelos fiéis. Funda também o Colégio de Genebra, que se torna um dos centros universitários mais importantes da Europa.
Sua doutrina é conhecida como calvinismo e diferencia-se do luteranismo na noção de predestinação: para Calvino, a salvação é uma escolha divina, cabendo ao homem cooperar com a vontade de Deus, qualquer que seja ela. De ideologia ascética e puritana, ele inspira, mais tarde, a religião presbiteriana. Morre em Genebra.