Em 1537 é nomeado professor da universidade italiana e dá aulas também em Pisa e Bolonha. Em 1544 torna-se médico particular de Carlos V e, em 1559, de Felipe II, ambos reis da Espanha. Publica em 1538, em Veneza, as Seis Pranchas Anatômicas, nas quais antecipa a moderna nomenclatura de anatomia. Sete Livros sobre a Estrutura do Corpo Humano, sua obra mais significativa e publicada em 1543, descreve os sistemas muscular e ósseo e contesta os ensinamentos dos médicos antigos.
É condenado à morte pela Inquisição em 1561, por haver dissecado um corpo humano. Felipe II consegue comutar a pena para uma peregrinação a Jerusalém. Morre na volta, quando o navio em que viaja naufraga na ilha de Zante, na costa da Grécia.